巯-烯点击反应在毛细管整体柱制备中的应用熊喜悦1彭泽强2舒彦1何海琴1陈应庄ls陈波1（1.湖南师范大学化学生物学及中药分析省部共建教育部重点：引发剂在光照或者加热的条件下裂解形成自由基，自由基夺取巯基上的氢原子，产生巯基自由基；巯基自由基进攻碳碳双键，使活性中心转移，产生烷基自由基；烷基自由基夺取巯基化合物上巯基的氢原子，再次产生巯基自由基，进入循环，其中第二步产生的巯基自由基可引发链增长也可以与自由基发生终止反应。　　目前，巯-烯点击反应主要用于有机聚合物整体柱和有机-硅基杂化整体柱的制备，包括表面衍生和一锅法两方面。本文将重点介绍近几年来巯-烯点击反应在整体柱制备中的研究进展。　　2巯-烯点击反应在整体柱制备中的应用2.1巯-烯点击反应表面衍生修饰整体柱相比硅胶整体柱表面衍生受限于硅羟基间的缩合反应，巯-烯点击反应适应范围更广，整体柱表面含有巯基或者烯键都可以衍生，这个特点大大拓宽了衍生范围。Chen等用四甲氧基硅烷（TMOS）和3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（y-MAPS）为前驱体制备了表面含有活性烯键的硅胶杂化整体柱，然后将二硫键被还原的胰蛋白酶注入整体柱，经过硫酸铵引发巯-烯点击反应，使胰蛋白酶成功固定到整体柱表面（图式2）。经此方法获得的酶微反应器获得了很好的酶解效率，胰酶特异性底物na-p-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐（TAME）在120s内即可完全酶解。固定后的酶经过上百次酶解反应后活性下降不明显。该方法为酶等活性大分子的活性衍生提供了可行的选择。　　图式2基于巯-烯点击反应制备胰蛋白酶微反应器Wang等基于前述工作进一步将巯-烯点击反应应用于烯基化整体柱表面的小分子修饰。他们首先以TMOS和乙烯基三甲氧基硅烷（VTMS）为前驱体，采用溶胶-凝胶法合成表面含有烯键的杂化整体柱，然后利用巯-烯点击反应在表面引入十八硫醇和3-巯基-1-丙磺酸等小分子，得到的整体柱在电色谱模式下成功分离了苯系物、酚类、苯胺类以及多肽等物质。Chen等合成了一种新型的集富集分离于一体的双相杂化整体柱，其中前一段整体柱合成预聚液包含TMOS、VTMS及甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐（SPMA），后段合成预聚液只包含TMOS和VTMS，两种预聚液依次灌入石英毛细管，热聚合成柱后得到前段表面含有磺酸基后段表面含有烯键的双相整体柱，磺酸基段用于富集功能，含烯键段经巯-烯点击反应衍生十八硫醇或者巯基己醇以实现不同分离功能（图式3）。　　图式3两段双功能有机-无机杂化整体柱的制备Scheme该两段法制备的杂化整体柱不仅成功富集并分离了苯胺类物质，还对低浓度牛血清白蛋白（BSA）的酶解产物进行富集和分离，证明了该双相整体柱具有应用于对低丰度蛋白多肽鉴定的潜力。　　胺（NAS）为单体，乙二醇二丙烯酸酯（EDMA）为交联剂合成了poly（NAS-⑶-EDMA）整体柱，通过胺丙炔或胺丙烯衍生使其表面炔基化或者烯基化，*后经巯-烯点击反应成功得到表面分别含金刚烷、纳米金和聚乙二醇整体柱（图式4）。特别是纳米金表面固定化整体柱，充分结合了整体材料高渗透性和纳米材料高比面积的特点，为新型整体材料的制备提供了新的发展方向。但是，上述整体柱均为有机聚合物基质，机械稳定性较差。另外，该方法制备过程较为繁琐，难以保证整体柱批次之间的重复性。　　不同于上面的修饰方法，Han等则用TMOS和巯丙基-三甲氧基硅烷通过溶胶-凝胶制备表面含有巯基的杂化整体柱，然后再与带有烯键的咪唑离子液体通过巯-烯点击反应修饰得到的整体柱在电色谱模式下对烷基苯类化合物有很好的分离效果。Lv等则先制备表面带有缩水甘油基的整体柱，化学进展，2014，26苯胺类物质在三种不同两段双功能杂化整体柱上的分离：在三个杂化整体柱的A部分相同（图式3），其中a柱的B部分表面未经修饰，b柱B部分表面衍生C18长链，柱6部分表面衍生正己醇；分析物：（1）对苯二胺，（2）苯胺，（3）对甲基苯胺，（4）邻甲基苯胺，（5）二甲基苯胺，（6）二苯胺图式4Poly（NAS-⑶-EDMA）整体柱的制备及表面修饰通过胱胺修饰使其表面巯基化，表面巯基分别与疏水长链单体、两性离子单体一起聚合，从而得到表面性质不同的功能化整体柱。表面修饰烷基长链的整体柱能疏水分离烷基苯类和蛋白等物质，而表面修饰两性离子的整体柱能亲水分离多肽、核苷等极性物质。　　2.2基于巯-烯点击反应一锅法制备杂化整体柱由于一锅法中功能单体是均匀渗透到整体柱中，而表面衍生的整体柱其功能单体只是分散在其表面，所以一锅法制备的整体柱比表面衍生而成的整体柱功能单体分布更均匀、密度更大且性能更为优越。目前来看，常用于一锅法的硅烷单体为TM0S和巯丙基三甲氧基硅烷，基本方法如图式5.图式5基于巯-烯点击反应一锅法制备有机-硅胶杂化整体柱Yang等采用一锅法制备了以3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐（SPMA）为功能单体的杂化硅胶整体柱，但是该杂化整体柱的pH应用范围较窄（39）。Liu等对一锅法作了进一步的改进，通过采用刚性纳米硅八乙烯基八硅倍半氧烷（0VS）为单体，经与3-巯基-1-丙磺酸钠（MPS）巯-烯点击反应后形成MPS-0VS，增加了0VS的水溶性，然后基于巯-烯点击反应一锅法制备了笼状纳米硅杂化整体柱（图式6）。由于含有0VS基质，整体柱的机械强度很好，耐pH范围（2. 711.2）比SPMA杂化整体柱更宽。从中看出，该整体柱表面含有疏水碳链和磺酸基，所以存在反相和阳离子交换两种作用。基于这个特点，该整体柱在毛细管电色谱模式下对苯胺类物质有很好的分离效果。4种物质按照苯胺、N-甲基苯胺、对甲苯胺和N，N-二甲基苯胺顺序，6min内完全分离，且峰型尖锐对称，这在传统C18柱上是很难达到的。另外，他们还以酚类物质为分析物进一步考察了该整体柱的色谱性能。如所示，这些分析物按照疏水性从弱到强的顺序依次洗脱，10min左右即可分离完全，柱效更是高达470000N/m.由此可见，相对传统的整体材料，整体材料与纳米材料相结合的新型分离材料具有更好的图式6MPS-OVS单体（A）及MPS-OVS杂化整体柱（B）的合成MPS-OVS杂化整体柱对苯胺类物质的分离色谱图。色谱条件：流动相，35%乙腈磷酸缓冲液（5mM，pH=8.0）；分离电压，15kV；进样量，10kV，3s；毛细管，总长35 cm，有效长度25cm，内径，75 pm；检测波长，203 nm.分析物：（1）硫脲，（2）苯胺，（3）对甲苯胺（4）-甲基苯胺，（5）W-二甲基苯胺发展前景。　　Chen等则用含季胺单体和酰胺单体基于巯基-烯点击反应一锅法制备了亲水整体柱，苯甲酸类物质、硝酸盐等无机离子在该柱上都得到了基线分MPS-OVS杂化整体柱对酚类物质的分离色谱图。色谱条件：流动相，35%乙腈磷酸缓冲液（10 mM，pH=3.0），其他条件与相同。分析物：（1）对苯二酚，（2）2-氨基苯酚，（3）苯酚，（4）间甲苯酚，（5）萘酚离。此外，该整体柱还成功分离了胞嘧啶等8种核苷、三磷酸腺苷等4种核苷酸，突破了常规色谱柱（心8）分离这些强极性物质的瓶颈。　　3结论和展望综上所述，巯-烯点击反应在整体柱制备领域应用已经取得初步成功，但就目前研究情况来看，发表的文章仍较少，并未得到充分应用。由于烯类单体和巯基化合物的种类非常多，使得巯基-烯单体聚合形成的整体柱材料具有良好的可设计性。因此，基于巯-烯点击反应，我们可以设计并制备反相、亲水作用及手性分离等新型分离材料。此外，由于巯-烯点击反应的定向性，酶微反应器等酶固定技术将得到快速发展。